Artiklen foreslår en ny mikrofluidisk chip -teknologi til multiplexdetektion af rejerpatogene mikroorganismer. Forskningsteamet integrerede multi-enzym isotermisk hurtig nukleinsyreforstærkning (MIRA) teknologi og realtidsfluorescensdetektionsmetoder. Denne mikrofluidiske chip tilvejebringer en hurtig, følsom og effektiv løsning til på-site detektion af større rejerpatogener.
Forskningsbaggrund og betydning
Den globale rejeropdræt industri er en af de vigtigste økonomiske komponenter inden for akvakultur, men industrien har længe været udsat for trusler fra en række patogene mikroorganismer. Disse patogener fører ofte til storskala død af rejer, der alvorligt påvirker produktion og økonomiske fordele. Inklusive akut hepatopancreatisk nekrosis sygdom (AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), infektiøs hypodermal og hæmatopoietisk nekrosevirus (IHHNV), rejerhemocyt iridovirus (shiv) og enterohepaticus (EHP) osv. Viruss, bakterier og parasitter stiger større trusler til skridserne.
Traditionelle patogendetekteringsmetoder, såsom polymerasekædereaktion (PCR -teknologi), har høj følsomhed og specificitet, men er komplekse at betjene, tage lang tid og stole på laboratorieudstyr. Disse begrænsninger gør PCR-teknologi uegnet til hurtig test på stedet. Mira-teknologi er blevet et molekylært detektionsværktøj, der er egnet til applikation på stedet på grund af dets hurtige amplifikationsegenskaber under konstant temperatur og normal temperatur.
Mira Technology Principle
Multi-enzym konstant temperatur hurtig nukleinsyrerforstærkningsteknologi (MIRA-teknologi) er en konstant temperaturforstærkningsteknologi, der er afhængig af synergien af flere funktionelle proteiner ved stuetemperatur for at opnå hurtig amplifikation af nukleinsyrer. Det er en virkelig bærbar hurtig nukleinsyreteknologi på stedet. Sammenlignet med PCR har MIRA flere fordele.
Design og innovation af mikrofluidiske chips
Skematisk diagram over RPA -detektionsplatform på ChIP for flere vigtige rejerpatogene mikroorganismer
(A) Struktur af en mikrofluidisk chip af disk. 1: Reaktionskammer; 2: Boldventil; 3: udstødningsport; 4: prøveudtagningsport;
(B) Eksploderet visning. 5: varmeforseglingsfilm; 6: Chip -underlag.
(C) Detaljeret layout af de seks sæt primere inden for sektoren. Hvert primersæt er præfikseret i et udpeget reaktionskammer.
(D) Komplet driftsprocedure on-chip RPA-detektionsplatform.
Artiklen foreslår en mikrofluidisk chip integreret med MIRA -teknologi til multiplexdetektion af rejerpatogene mikroorganismer. Mikrofluidisk teknologi kan kontrollere væsker inden for mikronniveau-kanaler til præcis manipulation og derved opnå effektiv og billig multi-måldetektion.
Chippen har følgende nøgle designfunktioner:
● Centrifugal mikrofluidisk chip
Chippen vedtager et centrifugaldrevsdesign ved hjælp af centrifugalkraft til jævnt at distribuere prøven til hvert reaktionskammer. Dette design forenkler driftsprocessen, og operatøren kan afslutte hele reaktionen ved blot at injicere prøven.
● Detektion af flere mål
Chippen er forudindlejt med de bakterietyper, der skal detekteres: akut hepatopancreatisk nekrose (V-AhpND), hvid pletsyndromvirus (WSSV), infektiøs subkutan nekrose virus (IHHNV), rejer hæmocyt iridovirus (SHIV) og enterohepatis hepatica (EHH). ) Primerprober for fem patogener. Dette design kan samtidig detektere seks genmål i en reaktion, hvilket muliggør hurtig screening af flere patogener.
● Fluorescensdetektion i realtid
Mira -teknologi -amplifikationsreaktionen i chippen er kombineret med en fluorescerende sonde, som kan overvåge fremskridt i amplifikationsreaktionen i realtid. Probe -designet tillader, at det fluorescerende signal kun frigives, når amplifikationsproduktet genereres, hvilket således opnås hurtig og følsom kvantitativ detektion.
● Reaktionssystem med lav koncentration
Hver reaktionsenhed af ChIP kræver kun et reaktionsvolumen på 5 μL, hvilket i høj grad reducerer reagensforbruget. Når hele systemet kører, kan op til fire prøver behandles samtidig, og hver prøve kan detektere fem patogener, hvilket i høj grad forbedrer detektionseffektiviteten.
Følsomhed, specificitet og gentagelighed
Udførelsen af ChIP -systemet inkluderer påvisning af symmetri, resonans og gentagelighed.
● Følsomhed
Eksperimentelle resultater viser, at ChIP kan detektere målgenkopiantal så lave som 10 kopier/μL, med følsomhed, der er sammenlignelig eller endda højere end traditionelle PCR -metoder. Denne høje følsomhed sikrer, at teknologien kan detektere tidlige inficerede individer i praktiske anvendelser og derved muliggøre tidlig screening af patogener.
● Specificitet
Eksperimentet udførte tværreaktionstest på en række ikke-målpatogener, og resultaterne viste, at ChIP er meget specifik for målpatogenerne og kan nøjagtigt skelne forskellige typer patogener. All tests for Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease (V-AHPND), White Spot Syndrome Virus (WSSV), Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus (IHHNV), Shrimp Hemacytic Iridescence Virus (SHIV) and Enterohepatitis Hepatica (EHP) The results all showed no cross-reaction, indicating that this method can Undgå effektivt ikke-specifik amplifikation.
● Gentagelighed
For at evaluere metodens stabilitet gennemførte forskerteamet flere gentagne eksperimenter. Resultaterne viste, at variationskoefficienten (CV -værdi) mellem forskellige eksperimenter var mindre end 10%, hvilket viste god eksperimentel gentagelighed og konsistens.
Feltanvendelser og fordele
Designet af MIRA -teknologi -mikrofluidisk chip giver det betydelige feltanvendelsesfordele, især egnet til hurtig påvisning og overvågning af patogener i rejeropdræt:
● Praktisk driftsproces
Hele detektionsprocessen kræver kun injektion af prøven i chippen og start af reaktionsenheden. Det kræver næsten ingen manuel betjening og er velegnet til, at ikke-professionelle skal bruges på stedet.
● Hurtig responsevne
Systemet kan opnå testresultater inden for 20 minutter, hvilket i høj grad forkorter testtiden. Dette er afgørende for hurtig sygdomsrespons på gårde og reducerer spredningen af patogener.
● Multiplex -detektionsevne
Fem hovedpatogener kan identificeres i en test, hvilket forbedrer detektionseffektiviteten i høj grad og sparer detektionsomkostninger og tid.
MIRA -teknologiske udsigter
Selvom PCR -teknologi længe er blevet bedømt som guldstandarden for detektion af nukleinsyreforstærkning, har MIRA -teknologi vist et stort anvendelsespotentiale på grund af dens hurtige reaktion ved konstant temperatur, enkel drift og krav til lavt udstyr. Ved at sammenligne med PCR kombineret med DNA -sekventering blev det konstateret, at detektionsresultaterne af den isotermiske amplifikations -chip er i overensstemmelse med PCR -resultaterne med hensyn til følsomhed og specificitet, og reaktionstiden for MIRA -teknologi er markant forkortet. Derfor betragtes MIRA-teknologi-mikrofluidiske chips som en teknologi, der er mere egnet til feltapplikationer, især i miljøer, der kræver hurtig og storskala patogendetektion.
Mikrofluidiske chips baseret på multi-enzym isotermisk hurtig nukleinsyreforstærkning (MIRA) -teknologi tilvejebringer et effektivt værktøj til påvisning af patogene mikroorganismer i rejeropdræt. Denne teknologi har fordelene ved høj følsomhed, god specificitet, let drift og hurtig detektionshastighed og har brede anvendelsesudsigter inden for forebyggelse og kontrol af akvakultursygdomme. Med yderligere udvikling og optimering af teknologien forventes systemet at blive anvendt til påvisning af flere akvatiske patogener, hvilket muliggør bredere sygdomsforebyggelse og overvågning.
Forskningsresultaterne tilvejebringer en pålidelig tidlig detektionsmetode for akvakulturindustrien, som effektivt kan reducere risikoen for sygdomsudbrud, forbedre produktionseffektiviteten og produktionen af gårde og lægge et teknisk fundament for den bæredygtige udvikling af akvakulturindustrien.