For at opnå signalamplifikation for spormængder af virale nukleinsyrer og give tilstrækkelige substrater til Cas14a udviklede vi aMIRA (asymmetrisk multienzyme isotermisk hurtig amplifikation) baseret på MIRA. Det resulterende aMIRA-Cas14a-system tilbyder følgende nøglefordele:
1. Optimeret primerstøkiometri gør det muligt for MIRA fortrinsvis at overproducere ssDNA, som tjener som det direkte substrat for Cas14a. Ved at justere fremad-til-omvendt primerforholdet til 20:1, genererer systemet tilstrækkeligt ssDNA til at aktivere den PAM-uafhængige spaltningsaktivitet af Cas14a, som specifikt genkender og spalter ssDNA.
2. One-pot-integration af MIRA og CRISPR-Cas14a eliminerer krydskontamineringsrisici.
3. MIRA øger detektionsfølsomheden markant, hvilket muliggør påvisning af virale nukleinsyrer med ultralav overflod.
4. aMIRA-Cas14a opretholder høj specificitet og undgår falske positiver forårsaget af ikke-specifik amplifikation.
I sidste ende eliminerer one-pot-integrationen af MIRA og CRISPR-Cas14a kontamineringsrisici og opnår perfekt synergi mellem MIRAs styrker og CRISPR-Cas14a-systemet. Dette løser den brancheomspændende udfordring med inkompatibilitet mellem isotermisk forstærkning og CRISPR-systemer, hvilket repræsenterer det centrale teknologiske gennembrud for MaC14a-platformen. aMIRA-Cas14a-systemet opnår en 1.000-fold forbedring af følsomheden, samtidig med at det sikrer specifik forstærkning. Kombineret med den sekvensspecifikke genkendelse af Cas14a giver dette dobbeltlagsspecificitetsvalidering uden krydsreaktivitet mod ikke-målvirus eller sunde prøver-, der adresserer et andet smertepunkt i industrien: tendensen til falske positiver.
MIRA multienzyme isotermiske hurtige amplifikationsreagenser, der blev brugt i denne undersøgelse, blev leveret af Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Ud over fremragende reagensydelse tilbyder Amp‑future Biotech også et professionelt og hurtigt responsivt teknisk supportteam.
MIRA demonstrerer stærk kompatibilitet med centrifuge-baserede mikrofluidchips udviklet til forsknings- og diagnostiske applikationer:
1. Miniaturiseret reaktionssystem, velegnet til reaktionskamre med mikro-volumen, der er karakteristiske for mikrofluidchips;
2. Multiplex detektionsevne i en enkelt kørsel;
3.Kompatibilitet med bærbare enheder, jævne arbejdsgange fra prøve til resultat.
vi udviklede en integreret bærbar "sample-in, answer-out" point-of-care testing (POCT)-enhed optimeret til feltimplementering, som illustreret i fig. 4A. Den kompakte prototype (23 cm (L) × 21 cm (B) × 14 cm (H), 12,5 kg total masse) opnår enestående bærbarhed. Systemets kernekomponenter omfatter en{11}}højpræcisions servomotor til nøjagtig rotationsstyring og en luftvarmeenhed til temperaturregulering. Et integreret optisk detektionsmodul, placeret under chippen, letter fluorescensexcitation og måling, hvilket sikrer høj følsomhed og nøjagtighed ved detektion. Den bærbare enhed er udstyret med et indlejret Android-operativsystem, der tilbyder en bruger-venlig grænseflade, hvor operatører kan vælge forudprogrammerede driftsfiler, der indeholder detaljerede parametre såsom reaktionstid og temperatur. Resultater og konklusioner vises i realtid-på en LCD-skærm, hvilket muliggør hurtig informationsindsamling. Derudover inkorporerer systemet et trådløst kommunikationsmodul, der understøtter{18}}realtidsdatatransmission til mobile enheder eller skyservere, integreret med kunstig intelligensalgoritmer til øjeblikkelig fortolkning og analyse af testresultater.
