Staphylococcus haemolyticus er en gram-positiv koagulase-negativ bakterie, der er meget almindelig på hospitaler. I de senere år har der været stigende bekymring på grund af den høje risiko for hospital-erhvervede infektioner. Staphylococcus haemolyticus kan yderligere forårsage hudinfektioner, meningitis, peritonitis og endda sepsis. Forsinkelser i klinisk diagnose kan føre til forringelse af sundhedsmæssige forhold, så hurtig diagnose af Staphylococcus haemolyticus er nøglen til præcis behandling.
Professor Ji Tuos forskningsgruppe fra Institut for Central Laboratorium i Lianyungang Second People's Hospital offentliggjorde en artikel "En hurtig og visuel detektion af Staphylococcus haemolyticus i kliniske prøver med MIRA-LFS" i tidsskriftet "Analytica Chimica Acta", med en påvirkningsfaktor på 6.2.
Oversigt over undersøgelsen
I denne undersøgelse etablerede professor Ji Tuos gruppe en metode til påvisning af staphylolyticus haemolyticus af MIRA-LFS baseret på MVAA-genet og anvendte multi-enzyme-konstant temperatur hurtig nukleinsyreamplifikationsteknologi MIRA kombineret med lateral flow-teststrip LF'er til at opnå hurtig patogen-detektion. Eksperimentet blev udført ved 37 grader, og resultaterne blev påvist inden for 9 minutter med en detektionsfølsomhed på 0. 147 CFU/reaktion. MIRA-LFS-detektionsmetoden er velegnet til fastpunktsdetektion af Staphylococcus haemolyticus i kliniske prøver, og realiserer metoden til identifikation af Staphylococcus haemolyticus ved POCT, som er af stor værdi for hurtig diagnose og behandling af sygdomme i undervurderede områder. Forskningsgruppen anvendte MIRA-LF'er, QPCR og traditionelle bakteriekulturmetoder til at analysere 95 tilfældige kliniske prøver og bekræftede den kliniske anvendelighed.
Forskningsmetoder
Et skematisk diagram over MIRA-LFS-testen er vist ovenfor. I denne undersøgelse blev Ampfuture Biotechs DNA -konstante temperatur hurtig amplifikationssæt (kolloidal guldteststrimmel) og nukleinsyretektionsteststrimmel anvendt.
Primerlængden af MVAA -genet var 30-35 nukleotider, og længden af amplifikationsproduktet var 100-350 bp, og i alt 6 par kandidatprimere blev designet. GDNA for standard stafylolytiske staphylococcus -stammer blev anvendt til MIRA -analyse, kandidatprimere blev screenet, og de amplificerede produkter blev visualiseret med 2% agarosegelelektroforese.
(Amplifikationsprodukter vises ved hjælp af Agarose Gel Electroforese)
Proben er derefter designet i henhold til den forreste primersekvens (16 bp bagud). Den 5 'ende af sonden er mærket med FITC, og 3' enden er mærket C3. Positionens nukleotid i sonden 31- i sonden erstattes med THF i en afstand af 30 bp fra 5' -enden og 15 bp fra 3' -enden. Den 5 'ende af den valgte omvendte primer er mærket med biotin.
(Skematisk diagram over tværdimerer og sekvensmodifikation af primer-sonde-kombinationer)
Derudover blev reaktionsbetingelserne til påvisning af MIRA-LF'er ved Staphylococcus haemolyticus optimeret. Tests udføres med 37 grader fra 4-12 min med 2 minutters intervaller. Resultaterne er vist i reaktionstiden på 8 minutter, og testlinjen er tydeligt synlig. Derudover udføres testen fra 22-52 grad med 5 graders intervaller. 37-42 grad er den mest passende temperatur til MIRA-LFS-detektion. Derfor var den optimale reaktionstid og temperatur af MIRA-LFS-metoden til Staphylococcus haemolyticus henholdsvis 8 minutter og 37 grader. Sammen med det faktum, at det endelige resultat visualiseres af LF'er inden for 1 minut, er den samlede detektionstid 9 minutter.
(Optimering af reaktionstid og temperatur)
Eksperimentelle resultater
1. Følsomhedsverifikation
Forskellige koncentrationer af genomisk DNA (GDNA) opnået fra serielle fortyndinger af Staphylococcus haemolytica-kulturer (1 0^6-10^0 Cfu/ml) blev testet for MIRA-LFS.
(Positivt signal ved forskellige koncentrationer)
Probabilistisk enhedsregressionsanalyse viste, at 95% LOD bestemt af MIRA-LFS-assayet var 0. 147CFU/reaktion.
(Begrænsning af detektionsberegning)
2. Specificitetsvalidering
Selektiviteten af MIRA-LFS-detektion blev bestemt ved analyse af 18 stammer af almindelige patogene mikroorganismer og 15 stammer af klinisk Staphylococcus haemolyticus. Resultaterne viste, at MIRA-LFS-testen var negativ for alle 18 andre patogene bakterier og positive for 15 verificerede kliniske prøver af Staphylococcus haemolyticus.
(8 stammer af standardpatogene bakterier og 15 stammer af klinisk hæmolytisk streptococcus blev testet henholdsvis)
MIRA-LFS-assayet har høj selektivitet og er velegnet til screening af Staphylococcus haemolyticus.
3. Faktisk prøvetestning
I alt 95 prøver blev tilfældigt opsamlet fra Lianyungang Second People's Hospital, herunder 35 prøver af hud og blødt væv, 16 prøver af urin, 14 prøver af sputum og 30 prøver af blod.
(95 kliniske prøver blev testet ved forskellige metoder)
Resultaterne viste, at detektionsmetoden var 100% i overensstemmelse med QPCR -metoden. Sammenlignet med guldstandarden (GB/T4789. 11-2003) var følsomheden og specificiteten af MIRA-LFS-assayet til identifikation af henholdsvis Staphylococcus haemolytica-infektion 100% og 98,73%. Disse resultater validerer yderligere den tekniske gennemførlighed af metoden til påvisning af Staphylococcus haemolyticus i kliniske prøver.
MIRA-LFS-metoden bruges til hurtig påvisning af Staphylococcus haemolyticus af POCT, som er effektiv, nøjagtig, enkel og omkostningseffektiv, hvilket er nyttigt til hurtig diagnose og behandlingsbeslutninger.