Justerbar kontrol af Cas12-aktivitet fremmer universel og hurtig én-pot-nukleinsyredetektion
Udgivet af: University of Science and Technology of China
Tidsskrift: Nature Communications
Impact Factor: 14,7
Ved hjælp af MIRA-teknologi blev der udviklet en universel én-pot fluorescerende nukleinsyredetektionsmetode (SURVEY) baseret på natriumheparin. Undersøgelser har vist, at natriumheparin kan regulere Cas12a-spaltningsaktiviteten ved at interferere med Cas12a-crRNA-bindingsprocessen. Ved at justere natriumheparinkoncentrationen er SURVEY kompatibel med både klassiske og suboptimale PAM-sekvenser og kan anvendes til flere Cas12-undertyper. Denne metode, med en detektionstid på kun 15-20 minutter, opnår en sensitivitet og specificitet, der overstiger 95 % til påvisning af abekopper-pseudovirus, influenza A-virus og SARS-CoV-2. Det er billigt-og giver en ny point-of-care-detektionsmetode til medicinsk feltdiagnose og miljøovervågning, der adresserer den vanskelige balance mellem sensitivitet og specificitet i traditionel CRISPR-diagnostik.
1. Undersøgelse af virkningsmekanismen for heparinnatrium
En fluorescerende probe blev tilføjet til Cas12a-crRNA-systemet indeholdende 10nM mål-DNA, og et hurtigt og signifikant fluorescerende signal blev observeret uden tilsætning af natriumheparin. Når 0,2 ug/ml natriumheparin blev tilsat, svarede det fluorescerende signal til kontrolgruppens signal, hvilket indikerer, at natriumheparin i høj grad hæmmede trans-spaltningsaktiviteten af Cas12a. 0.2ug/ml natriumheparin er den minimale hæmmende koncentration. Efterhånden som koncentrationen af natriumheparin stiger fra 0,2 ug/ml til 0,5 ug/mL, hæmmes cis--spaltningsaktiviteten af Cas12a gradvist, og ved 0,5 ug/mL hæmmes trans--spaltningsaktiviteten næsten fuldstændigt. Undersøgelser af natriumheparins virkningsmekanisme har vist, at de negativt ladede grupper af natriumheparin interfererer med den korrekte binding af crRNA til Cas12a og kan påvirke dannelsen af det binære crRNACas12a kompleks.
- MIRA-Cas12a one-pot-detektion
Efter at have valideret virkningsmekanismen for natriumheparin, udforskede papiret en one-pot-detektionsstrategi (MIRA-Cas12a), der kombinerede MIRA-amplifikation og Cas12a-medieret fluorescensdetektion i et enkelt rør.
I fravær af natriumheparin producerede MIRA-Cas12a-kombinationen intet signifikant fluorescenssignal inden for målgenkoncentrationsområdet på 0,1aM til 10fM. Ved 40 µg/mL natriumheparin blev der observeret et signifikant fluorescenssignal over målkoncentrationsområdet på 1aM (≈0,6 kopier/μL, volumen=30μL) til 10fM (≈6.000 kopier/μL, volumen=300 μL, følsomhed, der viser over 0-1 gange, følsomhed sammenlignet med et system uden natriumheparin.
Abekoppevirusskabelonkoncentrationen var 10 fM, og Cas12a-crRNA (100 nM) blev brugt til at detektere målgenerne f31 og b6r. Amplifikationsreaktionen blev afsluttet ved 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 og 20 minutter, og MIRA-amplifikationsproduktindholdet på forskellige tidspunkter blev analyseret på agarosegeler. De resulterende produkter blev derefter analyseret på agarosegeler under tre forskellige indstillinger: MIRA-heparinnatrium uden Cas12a, MIRA-Cas12a uden heparinnatrium og MIRA-Cas12a med heparinnatrium. Resultaterne viste, at i fravær af heparinnatrium blev nukleinsyreamplifikation forhindret på grund af den høje cis-spaltningsaktivitet af Cas12a. Imidlertid øgede tilsætningen af heparinnatrium markant nukleinsyreamplifikation på grund af reduktionen af Cas12a's cis-spaltningsaktivitet.
Artiklen viser, at en universel én-pot fluorescerende nukleinsyredetektionsmetode (SURVEY) baseret på natriumheparin kan opnås ved hjælp af både klassiske PAM og suboptimale PAM-sekvenser. Derudover er AsCas12a og AapCas12b ud over LbCas12a også meget brugt i CRISPR-Dx-metoder. I systemet, der anvender MIRA-AsCas12a, blev fluorescens kun observeret i nærvær af 40 ug/ml natriumheparin, hvilket indikerer, at det kan detektere 1fM af f31- og b6r-gener. I fravær af natriumheparin kan MIRA-AapCas12b detektere 1 f31- og b6r-gen. Administration af 20 ug/mL natriumheparin accelererede ikke kun påvisningshastigheden af MIRA-AapCas12b, men øgede også fluorescensintensiteten. Disse resultater indikerer, at metoden med én-potte, der er udviklet ved hjælp af natriumheparindosis, også kan anvendes til andre Cas12-undertyper.
